Hovedforskel-PCR vs RT-PCR

PCR og RT-PCR er to vigtige teknikker inden for molekylærbiologi. PCR blev udviklet af Kary Mullis i 1980'erne. Det er i stand til at øge antallet af kopier af et bestemt gen på en eksponentiel måde, hvilket letter detekteringen af ​​det pågældende DNA -fragment. Taq Polymerase er det enzym, der oftest bruges i PCR -systemer. Det er et termostabilt enzym. I RT-PCR efterfølges omvendt transkription af PCR. Enzymet, revers transkriptase er involveret i syntesen af ​​komplementært DNA fra RNA. Det hovedforskel mellem PCR og RT-PCR er det PCR bruger dobbeltstrenget DNA som skabelon, mens RT-PCR bruger RNA som skabelon.

Nøgleområder omfattet

1. Hvad er PCR - Definition, proces, ansøgning 2. Hvad er RT PCR - Definition, egenskaber, anvendelse 3. Hvad er forskellen mellem PCR og RT PCR - Sammenligning af vigtige forskelle

Nøglebetingelser: PCR, RT-PCR, Polymerase Chain Reaction, Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, DNA Template, DNA Polymerase, Denaturation, Annealing, Primer Extension

Hvad er PCR

PCR (Polymerasekædereaktion) er en relativt enkel, men revolutionerende metode. PCR anvender enzymets, DNA -polymerases evne til at syntetisere nye DNA -strenge på en komplementær måde til den tilbudte templatestreng. PCR er en uundværlig teknik, der bruges i både kliniske og forskningslaboratorier til funktionel analyse af gener, diagnose og overvågning af arvelige sygdomme, DNA -kloning, sekventering og gammel DNA -amplifikation. DNA -skabelon, nukleotider, primere og DNA -polymerase er de fire hovedkomponenter i PCR. Det DNA -skabelon er normalt et dobbeltstrenget DNA med målsekvensen, som skal amplificeres. Taq DNA -polymerase som er isoleret fra Thermus aquatics, er almindeligt anvendt i PCR. Det Pfu DNA -polymerase er en anden type DNA -polymerase med høj troværdighed. Både Taq og Pfu polymeraser er varmebestandige. Nukleotiderne tilsat af DNA -polymeraserne er adenin (A), guanin (G), cytosin (C) og thymin (T). Da DNA-polymerase kun kan tilføje et nyt nukleotid til en 3'-ende af en allerede eksisterende DNA-streng, kræves en oligonukleotidprimer til initiering af DNA-syntese. Kravet om en primer i PCR tillader kun afgrænsning af en bestemt region i skabelonen. Målsekvensen flankeres af fremadgående og bagudrettede primere. Ved afslutningen af ​​en PCR akkumuleres nye kopier kaldet amplikoner af en specifik DNA -sekvens i milliarder. Komponenterne i PCR'en bør optimeres på en sådan måde at forbedre PCR -ydeevnen og minimere fejl.

PCR er en automatiseret proces udført af termiske cyklister, som er i stand til at skifte mellem forskellige temperaturer. PCR er en proces i tre trin.

1. Denaturering -Den dobbeltstrengede DNA-skabelon adskilles i to enkelte tråde ved opvarmning til 94-95 ° C.
2. Glødning - Primerne frem og tilbage binder til de komplementære sekvenser i skabelonen. Temperaturen i dette trin afhænger af smeltetemperaturen for primerkombinationen.
3. Primer forlængelse - DNA -polymeraseenzym forlænger hver af primerne ved deres 3' -ende ved at tilføje komplementære baser til den voksende streng. Den optimale temperatur for Taq -polymerase, 72 ° C, bruges som temperaturen i forlængelsestrinnet. Tidspunktet for forlængelsen afhænger af antallet af basepar i skabelonstrengen.

De tre trin gentages i 28-35 gange.

Figur 1: Polymerasekædereaktion

Produkterne fra PCR fraktioneres i størrelse med agarosegelelektroforese i sammenligning med en DNA -stige. Visualiseringen af ​​DNA på en agarosegel udføres ved farvning med ethidiumbromid og observation under UV. De amplificerede DNA-bånd under UV i en ethidiumbromid-farvet gel er vist i figur 2. DNA-stigen er vist i den yderste brønd.

Figur 2: DNA -bånd

Hvad er RT-PCR

RT-PCR (Omvendt transkriptions-polymerasekædereaktion) er en af ​​de mest følsomme teknikker, der bruges til påvisning af mRNA. RNA er den passende skabelon til indsamling af information enten om genekspression af et normalt væv eller genekspression af et inficeret væv. Skabelonen til RT-PCR kan enten være totalt RNA eller henholdsvis viralt eller bakterielt RNA. RNA transkriberes omvendt til komplementært DNA (cDNA) af enzymet, revers transkriptase. Den optimale temperatur for revers transkriptase er 46 ° C. CDNA'et bruges i PCR for at opnå produktet. Trin i reverse transkription PCR er vist i figur 3.

Figur 3: RT-PCR

RT-PCR kan udføres i to-trins eller et-trins reaktioner. I totrinsreaktionen udføres omvendt transkription og PCR i to separate trin. I et-trins RT-PCR efterfølges revers transkription af PCR i et enkelt rør på en sekventiel måde. Både cDNA og det endelige PCR -produkt kan køres på en agarosegel til størrelsesfraktionering og visualisering. Et-trins og to-trins RT-PCR er vist i figur 4.

Figur 4: Et-trins og to-trins RT-PCR

Forskellen mellem PCR og RT-PCR

Definition

PCR: PCR er en teknik, der bruges i molekylærbiologi til at forstærke et segment af DNA, der genererer millioner af kopier af en DNA -sekvens.

RT-PCR: RT-PCR er en variant af PCR, der anvendes til påvisning af genekspression i molekylærbiologi.

Trin

PCR: Denaturering, annealing og forlængelse er de tre trin i PCR.

RT-PCR: I RT-PCR efterfølges omvendt transkription af PCR.

Skabelon

PCR: Et dobbeltstrenget DNA-molekyle fungerer som skabelon for PCR.

RT-PCR: Et enkeltstrenget RNA-molekyle fungerer som skabelonen for den omvendte transkription. Et enkeltstrenget DNA-molekyle fungerer som skabelonen for PCR.

Enzymer brugt

PCR: DNA -polymerase bruges som enzym i PCR.

RT-PCR: Revers transkriptase og DNA-polymerase anvendes som enzymer i RT-PCR.

Primere

PCR: Frem og tilbage primere anvendes i PCR.

RT-PCR: Kun omvendt primer bruges til revers transkription, og både frem og tilbage primere bruges i PCR.

Følsomhed

PCR: PCR er en følsom metode.

RT-PCR: RT-PCR er mere følsom end PCR.

Ansøgninger

PCR: PCR bruges til funktionel analyse af gener, diagnose og overvågning af arvelige sygdomme, DNA -kloning, DNA -sekventering og gammel DNA -amplifikation.

RT-PCR: RT-PCR bruges til påvisning af genekspression.

Konklusion

PCR og RT-PCR er to de vigtige teknikker, der bruges i molekylærbiologi. Både PCR og RT-PCR er automatiserede teknikker, der er i stand til eksponentielt at øge antallet af kopier af en mål-DNA-sekvens, som er defineret af fremad- og bagud-primerne. I PCR bruges dobbeltstrenget DNA som skabelon. Ved PCR kan DNA -kloning, DNA -sekventering og funktionel analyse af generne udføres. I RT-PCR kan genekspression i et bestemt væv observeres ved at amplificere RNA. Hovedforskellen mellem PCR og RT-PCR er i deres skabeloner, der bruges i hver reaktion og deres applikationer.

Reference:

1. ”Polymerase Chain Reaction (PCR).” Nationalt center for bioteknologisk information. U.S.National Library of Medicine, n.d. Web. Tilgængelig her. 1. juni 2017. 2. ”Polymerase Chain Reaction (eller PCR).” Kloning og molekylær analyse af gener. N.p., n.d. Web. Tilgængelig her. 1. juni 2017. 3. Biolabs, New England. "CDNA-syntese og RT-PCR." CDNA-syntese og RT-PCR | NEB. N.p., n.d. Web. Tilgængelig her. 1. juni 2017.

Billede høflighed:

1. "Polymerasekædereaktion" Af Enzoklop-Eget arbejde (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia 2. "DNA fragmendid etiidiumbromiidiga värvitud agaroosgeelis." Af Rainis Venta-Eget arbejde (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia 3. "Omvendt transkription polymerasekædereaktion" Af Jpark623-Eget arbejde (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia 4. "Et-trin vs to-trins RT-PCR ”Af Jpark623-Eget arbejde (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia