Hovedforskel - PCR vs QPCR

PCR (polymerasekædereaktion) og qPCR (kvantitativ PCR) er to teknikker, der bruges inden for bioteknologi til at amplificere DNA til forskellige formål. PCR er en relativt simpel teknik. qPCR er også kendt som real-time PCR eller digital PCR. Det hovedforskel mellem PCR og qPCR er det PCR er en kvalitativ teknik, hvorimod qPCR er en kvantitativ teknik. PCR gør det muligt at læse resultatet som "tilstedeværelse eller fravær". Men i qPCR kvantificeres mængden af ​​DNA, der amplificeres i hver cyklus. Hvis RNA bruges i PCR, er teknikken kendt som RT-PCR (reverse transcription PCR), og hvis RNA bruges i qPCR, er teknikken kendt som qRT-PC.

Nøgleområder omfattet

1. Hvad er PCR - Definition, processer, anvendelser 2. Hvad er QPCR - Definition, processer, anvendelser 3. Hvad er lighederne mellem PCR og QPCR - Oversigt over fælles funktioner 4. Hvad er forskellen mellem PCR og QPCR - Sammenligning af vigtige forskelle

Nøglebetingelser: Agarose Gel Electrophoresis, Amplicons, DNA polymerase, Fluorescent Dye, PCR, Probes, qPCR, RT-qPCR

Hvad er PCR

PCR henviser til en teknik inden for bioteknologi, der tillader analyse af en kort sekvens af DNA ved at amplificere et udvalgt DNA -segment. Det er forholdsvis en følsom metode, da meget små mængder kræves ved en enkelt reaktion. Teknikken er baseret på DNA -polymerasens evne til at syntetisere nye DNA -strenge til den tilbudte skabelonstreng på en komplementær måde. Reaktionsblandingen af ​​PCR består af DNA -polymerase, DNA -nukleotider, primere, DNA -skabelonen, der skal amplificeres, og magnesium. Amplifikationen udføres inde i en termocykler. DNA -polymerase bør være varmebestandig, da der anvendes høje temperaturer i denne reaktion. De to typer DNA -polymeraser, der anvendes i PCR, er Taq DNA -polymerase og Pfu DNA -polymerase. Taq DNA -polymerase bruges meget i PCR.

DNA-polymerase kræver en allerede eksisterende DNA-streng i 3'-enden for at syntetisere en ny streng. Derfor tilsættes en oligonukleotidprimer til reaktionsblandingen til initiering af DNA -syntese. Kravet om en primer i PCR tillader kun amplifikation af et specifikt område i skabelonen. Målsekvensen flankeres af fremadgående og bagudrettede primere. I slutningen af ​​en PCR kaldes nye kopier af en specifik DNA -sekvens amplikoner, akkumuleres i milliarder. Komponenterne i PCR'en bør optimeres på en sådan måde at forbedre PCR -ydeevnen og minimere fejl. Standard PCR -reaktionen er vist i figur 1.

Figur 1: PCR

Trin i PCR

De tre trin i en PCR er beskrevet nedenfor.

1. Denaturering -Den dobbeltstrengede DNA-skabelon adskilles i to enkelte tråde ved opvarmning til 94-95 ° C.
2. Glødning - Frem og tilbage primere binder til de komplementære sekvenser i skabelonen. Temperaturen afhænger af smeltetemperaturen for primerkombinationen.
3. Primer forlængelse - DNA -polymeraseenzym forlænger hver primer ved deres 3' -ende ved at tilføje komplementære baser til den voksende streng. Den optimale temperatur for Taq -polymerase, dvs. 72 ° C, anvendes som temperaturen i forlængelsestrinnet. Tidspunktet for forlængelsen afhænger af antallet af basepar i skabelonstrengen.

De tre trin gentages i 28-35 gange. Agarosegelelektroforese bruges til størrelsesfraktionering af PCR -produkter. Produktet farves af ethidiumbromid og observeres under UV. PCR -produktet eller det amplificerede DNA kan anvendes til kloning, sekventering eller genotypebestemmelse.

Hvad er QPCR

QPCR henviser til en teknik inden for bioteknologi, der tillader påvisning, karakterisering og kvantificering af nukleinsyrer til forskellige anvendelser. Derfor er det en type kvantitativ PCR. Både DNA og RNA kan bruges som qPCR. Hvis RNA bruges som skabelon, skal det først transkriberes til cDNA. Denne type qPCR er således kendt som RT-qPCR. Den traditionelle PCR udføres for cDNA eller sædvanlig DNA -prøve. Men i qPCR bruges fluorescerende farvestoffer til at mærke PCR -produktet i hvert trin i PCR -cyklussen. Dette muliggør indsamling af data efterhånden som PCR skrider frem, hvilket muliggør kvantificering af amplikoner under den eksponentielle fase af PCR. Den vigtigste type farvestof, der bruges i qPCR, er SYBR Green. Farvestoffet binder sig til det dobbeltstrengede DNA. Da fluorescensen øges proportionalt med mængden af ​​amplificeret DNA, kan kvantificeringen udføres i "realtid". Den største ulempe ved brugen af ​​farvestoffet er, at det muliggør kvantificering af et specifikt produkt i prøven. Ud over farvestoffer kan prober også bruges i kvantificeringsprocessen. TaqMan -prober er en af ​​hovedtyperne af oligonukleotidprober, der bruges i qPCR, og processen med fluorescensemission er vist i figur 2.

Figur 2: TaqMan -sonde

Prober kan designes på en sådan måde at detektere flere PCR -produkter inden for samme prøve. TaqMan -sonde er en af ​​hovedtyperne af hydrolysesonder; inkorporering af denne sonde i PCR -produktet udsætter fluoroforen og udsender fluorescensen. Fluorescerende farvestoffer er mere specifikke for PCR -produktet. Derfor bruges de i de fleste diagnostiske assays til at påvise PCR -produktet.

Ligheder mellem PCR og QPCR

Forskellen mellem PCR og QPCR

Definition

PCR: PCR er en teknik inden for bioteknologi, der tillader analyse af en kort sekvens af DNA ved at amplificere et udvalgt DNA -segment.

QPCR: QPCR er en teknik inden for bioteknologi, der tillader påvisning, karakterisering og kvantificering af nukleinsyrer til forskellige anvendelser.

Kvantitativ/kvalitativ

PCR: PCR er en kvalitativ teknik.

QPCR: QPCR er en kvantitativ teknik.

Påvisning af produktet

PCR: Produktet detekteres ved agarosegelelektroforese i PCR.

QPCR: Produktet kan detekteres i hver amplifikationscyklus i qPCR.

Indsamling af data

PCR: Dataene indsamles ved afslutningen af ​​reaktionen i PCR.

QPCR: Dataene indsamles i den eksponentielle fase af reaktionen i qPCR.

Løsning

PCR: PCR har en meget dårlig opløsning.

QPCR: QPCR har en meget høj opløsning.

Farvestoffer

PCR: PCR bruger ethidiumbromid til at plette produktet under PCR.

QPCR: QPCR bruger fluorescerende farvestoffer til at detektere produktet.

Tid

PCR: PCR er en mere tidskrævende metode.

QPCR: QPCR er mindre tidskrævende.

RNA

PCR: RT-PCR er den type PCR, der bruger RNA som skabelon.

QPCR: RT-qPCR er den type qPCR, der bruger RNA som skabelon.

Rolle

PCR: PCR bruges til at påvise tilstedeværelse eller fravær af visse genomiske fragmenter.

QPCR: QPCR bruges til at kvantificere et bestemt fragment i en prøve.

Konklusion

PCR og qPCR er to typer teknikker, der bruges inden for bioteknologi til at amplificere DNA til forskellige formål. PCR er den traditionelle amplifikationsmetode, der bruges til at identificere tilstedeværelse eller fravær af et DNA -fragment. QPCR bruges til at kvantificere et bestemt fragment i en prøve. Således er PCR en kvalitativ teknik, hvorimod qPCR er en kvantitativ teknik. Dette er den største forskel mellem PCR og qPCR.

Reference:

1. "QPCR vs Digital PCR vs. traditionel PCR." Thermo Fisher Scientific, tilgængelig her.

Billede høflighed:

1. "PCR" Af Madprime-Eget arbejde (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia2. "Taqman" Af bruger: Braindamaged - Eget arbejde af den originale uploader (Public Domain) via Commons Wikimedia