Det hovedforskel mellem DNA og RNA -ekstraktion er, at pH -niveauet på DNA -ekstraktion er pH 8, hvorimod pH -niveauet for RNA -ekstraktion er pH 4,7. DNA har en tendens til at denaturere og bevæge sig til den organiske fase ved sur pH. Ved alkalisk pH undergår RNA alkalisk hydrolyse på grund af tilstedeværelsen af ​​2 ′ OH i ribosesukkeret.

DNA- og RNA -ekstraktion er de to procedurer, der er involveret i isolering og oprensning af nukleinsyrer fra cellerne i væv. Begge procedurer består af tre trin. God kvalitet DNA og RNA spiller en kritisk rolle i molekylærbiologi, bioteknologi, genomik og epidemiologiske eksperimenter.

Nøgleområder omfattet

1. Hvad er DNA -ekstraktion - Definition, procedure 2. Hvad er RNA -ekstraktion - Definition, procedure 3. Hvad er lighederne mellem DNA og RNA -ekstraktion - Oversigt over fælles funktioner 4. Hvad er forskellen mellem DNA- og RNA -ekstraktion - Sammenligning af vigtige forskelle

Nøglebetingelser: Cellelyse, denaturering af proteiner, DNA -ekstraktion, pH, nedbør, RNA -ekstraktion

Hvad er DNA -ekstraktion

DNA -ekstraktion er isolerings- og oprensningsproceduren for DNA. DNA kan isoleres fra blod, frosne vævsprøver eller paraffinvævsblokke. De tre trin i DNA -ekstraktion er cellelyse, isolering af DNA og udfældning. Under cellelyse bryder cellemembranbarrierer, såsom cellemembran og kernerne i kernen, for at eksponere DNA. Det næste trin er fjernelse af membranlipider fra prøven. Endelig involverer præcipitation af DNA fjernelse af DNA-associerede proteiner ved protease og fjernelse af RNA med RNase.

Figur 1: DNA -ekstraktionsprocedure

Grundlæggende protokoller for DNA -ekstraktion

Nedenfor er vist de grundlæggende protokoller for DNA -ekstraktion.

1. Cellelyse med cellelysebufferen til lysering af cellemembraner

2. Lipider nedbrydes med rengøringsmidler og overfladeaktive stoffer

3. Fordøjelse af proteiner ved tilsætning af protease

4. Fordøjelse af RNA ved tilsætning af RNase

5. Adskillelse af celleaffald, fordøjede proteiner, lipider og RNA ved tilsætning af koncentreret salt efterfulgt af centrifugering

6. Ethanoludfældning af DNA med iskold ethanol eller isopropanol. Natriumacetatets ionstyrke kan bruges til at forbedre nedbør. Det udfældede DNA vises som tråde i den endelige opløsning.

Figur 2: Ekstraheret DNA

Phenol-chloroform-ekstraktion kan også bruges til at adskille DNA fra proteiner. Her denaturerer phenol proteinerne i prøven, og DNA'et forbliver i den vandige fase ved afslutningen af ​​ekstraktionen. Og i den organiske fase kan du finde de denaturerede proteiner. En anden metode til ekstraktion af DNA er minicolumn -oprensningen. Her er binding af DNA til søjlen afhængig af pH og saltkoncentrationen af ​​bufferen.

Hvad er RNA -ekstraktion

RNA -ekstraktion refererer til processen med at rense RNA fra prøver. Den konventionelle metode til RNA -ekstraktion kaldes guanidiniumthiocyanat-phenol-chloroform-ekstraktion. Guanidinium thiocyanat denaturerer proteiner. Desuden forstyrrer det hydrogenbinding af vandmolekyler og fungerer som det kaotropiske middel. Et særligt reagens bruges i RNA -ekstraktionen kaldet Tri-reagens. Den indeholder guanidiniumthiocyanat, phenol og natriumacetat. Formålet med de grundlæggende trin ved RNA -ekstraktion ligner det i DNA -ekstraktion. Protokollen for RNA -ekstraktion er beskrevet nedenfor.

1. Celler vaskes med iskold PBS for at opretholde cellers osmolaritet.

2. Aspirer cellerne og homogeniser prøven med Tri-reagens.

3. Tilsæt chloroform og ryst.

4. Centrifugering kan resultere i tre lag. Det øverste lag er det vandige lag, som er klart. Det midterste lag eller interfasen indeholder det udfældede DNA. Bundlaget er det organiske lag, som er lyserødt.

5. Fjern det vandige lag, og tilsæt isopropanol. Centrifugering kan resultere i en pellet.

6. Vask pelleten med 75% ethanol. Lufttørre pelleten.

7. Opløs pelleten med TE -buffer eller vand.

Figur 3: Phenol-chloroform-ekstraktion af RNA

RNA -ekstraktion udføres generelt ved pH under 7. Ved alkalisk pH er RNA mere tilbøjelig til at blive nedbrudt ved alkalisk hydrolyse på grund af tilstedeværelsen af ​​en OH -gruppe ved 2 ′ position af ribosesukkeret. Derudover har RNA en tendens til at forblive i den vandige fase ved surt pH. På den anden side har DNA en tendens til at denaturere og bevæge sig ind i den organiske fase ved sur pH. Derfor kan DNA -ekstraktion udføres ved ca. pH 8. DNA består af deoxyribosesukker og undergår ikke alkalisk hydrolyse.

Ligheder mellem DNA og RNA -ekstraktion

Forskellen mellem DNA og RNA -ekstraktion

Definition

DNA -ekstraktion: Isolering og oprensningsprocedure af DNA

RNA -ekstraktion: Proces til oprensning af RNA fra prøver

Type nukleinsyre ekstraheret

DNA -ekstraktion: DNA

RNA -ekstraktion: RNA

pH

DNA -ekstraktion: Udfærdiget den 8

RNA -ekstraktion: Udfærdiget den 4.7

Trin

DNA -ekstraktion: Bryde cellemembraner eller cellelyse, fjerne membranlipider og udfælde DNA

RNA -ekstraktion: Cellelyse, guanidiniumthiocyanat-phenol-chloroformekstraktion, præparat med isopropanol

Brug af DEPC-behandlet vand

DNA -ekstraktion: Ingen

RNA -ekstraktion: Alle reagenser fremstilles med DEPC-behandlet vand

Opbevaring

DNA -ekstraktion: DNA kan ekstraheres forud og opbevares i partier

RNA -ekstraktion: RNA -ekstraktion udføres lige før procedurerne nedstrøms

Langtidsopbevaring

DNA -ekstraktion: Ved -20 ° C

RNA -ekstraktion: Ved -80 ° C

Konklusion

DNA -ekstraktion udføres ved pH 8. DNA har tendens til at bevæge sig til den organiske fase, da denaturerer ved sur pH. Men RNA -ekstraktion udføres ved lav pH for at forhindre nedbrydning ved alkalisk hydrolyse. Det grundlæggende formål med trinene med både DNA- og RNA -ekstraktion er ens. Hovedforskellen mellem DNA- og RNA -ekstraktion er pH -betingelserne, der anvendes i hver ekstraktionstype.

Reference:

1. "Det grundlæggende i DNA -ekstraktion." Alaska BioPREP Virtual Textbook, Alaska BioPREP University of Alaska Fairbanks, tilgængelig her2. "RNA -isolering og omvendt transkriptionsprotokol: Celler i kultur." abcam, tilgængelig her

Billede høflighed:

1. "Figur 17 01 02" Af CNX OpenStax-(CC BY 4.0) via Commons Wikimedia 2. "DNA-ekstraktion" Af Joo Nath-Eget arbejde (CC BY-SA 4.0) via Commons Wikimedia 3. "PhOH-CHCl3-ekstraktion" Af Squidonius (snak)-Eget arbejde (Originaltekst: selvfremstillet) (Public Domain) via Commons Wikimedia